測(cè)定意義：                         

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體95％以上的活性氧（ROS）都來(lái)自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程有關(guān)。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)多，就可破壞線粒體酶類(lèi)、脂類(lèi)和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。

因此，通過(guò)檢測(cè)活性氧的變化來(lái)判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測(cè)定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過(guò)線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無(wú)熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。

需自備的儀器和用品：

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。              

試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存。臨用前加入22mL試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑四：液體×1支，4℃保存。

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算